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miR-21 对小鼠心肌重构相关基因调节作用的研究

作者：张越易青陈晶孙一日期：2015-12-07 13:50 来源：未知

摘要：目的本研究探讨了 miR-21抑制剂对小鼠心衰模型心肌重构相关基因 MMP2、MMP7基因表达的影响，为心衰时心肌重构的发病机制和心衰的治疗方法提供新的思路和实验依据。方法本研究通过建立小鼠心衰模型，采用实时荧光定量 PCR方法检测 miR-21抑制剂对 MMP2、MMP7 mRNA 表达的影响。结果实时荧光定量 PCR显示，miR-21抑制剂下调小鼠心肌 MMP2 mRNA 的表达，对 MMP7表达没有显著影响。结论 miR-21 抑制剂调控参与心肌重构的重要基因。
关键词：心肌重构；基质金属蛋白酶 2；基质金属蛋白酶 7
心肌重塑是许多心血管疾病进展的标志，以心肌细胞肥大和心肌纤维化为主要特征。心肌纤维化最终会导致心力衰竭。病理性心室重塑中细胞外基质的合成增加而降解减少, 结果使细胞外基质总量增加, 产生纤维化。核酸内切酶Dicer 负责剪切 miRNA 形成约为 22 个核苷酸的长度成熟的miRNA 双链，研究发现，幼鼠心肌的 Dicer 基因敲除会导致心室重构和心肌纤维化，这暗示了 miRNA 参与了心肌纤维化等病理改变 [1]。
1 材料与方法
1.1 心衰模型构建
取健康 10 周龄 C57 小鼠（清洁级），称重后麻醉，将小鼠固定于操作台的恒温垫上，做气管插管，接小动物呼吸机控制呼吸。无菌操作，左侧胸部备皮后心尖搏动最强处做切口，逐层剪开分离肌肉至暴露肋骨，用镊子分离心包膜后暴露左心耳和左心室，双目显微镜下可见左冠状动脉自左心耳缘中部向下走行，用无损伤丝线于左心耳下缘 2mm 左冠状动脉走形处做结扎，将心脏归位，膨肺，逐层关胸。观察小鼠呼吸情况，待小鼠恢复自主呼吸后关闭呼吸机，脱机后保留插管观察，至苏醒后拔出气管插管。对照组为同期开胸假手术组，除不结扎冠状动脉外，余过程同心力衰竭组。8 周后做超声心动图确定建模成功。心衰动物模型分为两组，一组小鼠左冠状动脉结扎术后六周尾静脉注射特异的 miR-21 反义核苷酸连续 7 天，另一组心衰小鼠作为对照组注射非特异的阴性对照 miRNA。
1.2 RNA 提取、反转录以及实时荧光定量 PCR 实验按照操作说明用总 RNA 提取试剂盒提取左心室总 RNA，反转录成 cDNA，cDNA 加入通用 Taqman mastermix， ABI 设计优化的探针及引物，cDNA 模板以及去离子水。反应物加到96 孔板中，.将96 孔板放入离心机中离心去除挂壁液体。将反应混合液放入实时荧光定量 PCR 仪进行循环反应，我们采用绝对定量方法计算出 18S、MMP 以及MMP2 的表达量，并且采用保守的 18s 作为内参，将 MMP2、MMP7 的表达归一化到内参 18s 的表达。数据处理统计分析实验数据以均数±标准差表示，应用 SPSS 11.0 统计软件进行 student ttest 检验。以 <0.05 为有差异， <0.01 为有显著性差异。
2 结果
miR-21 对小鼠心脏MMP2（基质金属蛋白酶 2）以及小鼠心脏 MMP7（基质金属蛋白酶7）表达的影响：
心衰小鼠模型尾静脉注射连续注射 miR-21 抑制剂或者阴性对照7天后，取小鼠左心室，提取总RNA，反转录成cDNA，实时荧光定量 PCR 结果见图 1 和图 2，MMP2 mRNA 基因绝对定量结果显示 miR-21 抑制剂可以明显下调 MMP2 mRNA 的表达，但是对 MMP7 基因的表达没有影响。我们采用绝对定量方法计算出 18S、MMP2 以及 MMP7 的表达量，并且采用保守的 18s 作为内参，将 MMP2 和 MMP7 的表达归一化到内参 18s的表达。

3 讨论
近年来的研究发现 miR-21 在多种实验动物心衰模型以及心衰患者的心肌中表达上调。表明 miR-21 表达的特异性改变在心力衰竭病理过程中可能具有重要作用。
心肌纤维化最终会导致心肌重构以及心力衰竭的发生和发展。MMPs（基质金属蛋白酶，可使纤维胶原降解的蛋白水解酶）和 TIMPs (组织金属蛋白酶抑制剂) 之间表达失衡状态在心室重构中起重要作用。目前的 MMP 抑制因子均有不同程度的副作用，因此鉴定新的 MMPs 抑制因子对缓解心肌纤维化具有重要的意义。 MMP2在细胞外基质平衡中起重要作用，我们证明了 miR-21 抑制剂可以降低小鼠心脏梗死区域MMP2 的表达，进而有可能抑制成纤维细胞迁移和心肌纤维化，这为开发治疗心力衰竭的新药打下了基础。研究表明 miR-21 抑制剂可以调控心肌的纤维化[2]。但是其在心脏中已经验证的调控基因却寥寥无几。
据报道 miR-21 在人心力衰竭患者的心肌中表达上调并且可以促进心肌纤维化的进程 miR-21 是心肌细胞发生房颤的重要的信号分子[3]，而 MMP7 在心衰患者心肌细胞中的表达上调，我们在本研究中探索了 miR-21 抑制剂是否影响影响人心肌成纤维细胞中基质金属蛋白酶（MMP7）的表达，进而影响房颤的信号通路。 miR-21 抑制剂具有抗肿瘤以及抑制纤维化的作用，将来有望用于新药开发，所以我们有必要对其调控机制进行深入。
参考文献
[1]da Costa Martins PA, Bourajjaj M, Gladka M, et al. Conditional dicer gene deletion in the postnatal myocardium provokes spontaneous cardiac remodeling. [J].Circulation,2008, 118: 1567-1576
[2]Cheng Y,Zhang P,Yang J,etal. Ischaemic preconditi oning-regulated miR-21 protects heart against  ischa emic/reperfusion injury  via  anti-apoptosis thro  ugh its target CDPD4 [J].Cardiovasc  Res,2010,87(3): 431-439
[3]Sophie Cardin,Eduard Guasch, Xiaobin Luo, Patrice Naud, et al;  [J].Physiology.2012,5;(1027-1035)
基金项目:国家自然科学基金面上项目（81070128）；l 辽宁省杰出青年学者成长计划（教育厅优秀人才项目  No. L2011112）；教育部留学启动基金（20121707）；人力资源与社会保障部科技项目择优资助(2015)；沈阳医学院优秀人才项目（20113067）。大学生科研立项课题（20141038）
*通讯作者（To whom correspondence should be addressed）