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miR-21 抑制剂对人心脏成纤维细胞Smad7 表达调控作用的研究

作者：张越* 唐云陈晶日期：2015-11-30 13:21 来源：未知

摘要：目的本研究探讨了 miR-21抑制剂对人心脏成纤维细胞 Smad7 mRNA 表达的影响。方法本研究通过转染人心脏成纤维细胞，采用实时荧光定量 PCR方法检测 miR-21抑制剂对 Smad7 mRNA 表达的影响。结果实时荧光定量 PCR 显示， 100nM miR-21抑制剂对人心脏成纤维细胞 Smad7 mRNA 的表达没有显著影响。结论 100nM miR-21 抑制剂对表达无影响。
关键词：人心脏成纤维细胞；心肌重构；Smad7

MicroRNA(miRNA)是近几年在真核生物中发现的一类具有调控功能的单链小分子非编码 RNA，miRNA-21 在多种器官的纤维化中起重要作用。研究表明心脏纤维化与 miRNA-21异常升高有关 1。Smad3 、Smad7 基因近年来已被认为是与器官纤维化密切相关。
1 材料与方法
1.1 主要试剂
miR-21 抑制剂及阴性对照（Exiqon 公司，丹麦）， Trizol (invitrogen 公司，美国),miRNA 阴性对照，smad7、18S 探针（ABI，美国），反转录试剂盒（ABI，美国），mastermix（ABI，美国）。RNA 提取试剂盒（Qiagen）。
1.2 转染
用 sciencecell 公司的成纤维细胞专用转染试剂FibroFectagenB 按照说明书将 miR-21 抑制剂反式转染进人心脏成纤维细胞，终浓度为 100nM。
1.3 RNA 提取以及反转录
用 Qiagen miRNeasy kit 提取细胞总 RNA，用 Nanodrop定量 RNA 浓度与纯度后，反转录成 cDNA。
1.4 实时荧光定量 PCR 实验
按照操作说明 96 孔板每孔加入 20X TaqMan Gene Expression Assay 1ul、20X TaqMan Gene Expression Master Mix 10ul、cDNA template 4ul、RNase-free water 5ul。将反应混合液放入实时荧光定量PCR仪进行循环反应。 18S、Smad7 探针序列为 ABI 公司设计优化具有专利，我们采用绝对定量方法计算出 18S、Smad7 的表达量，并且采用保守的18s 作为内参，将 Smad7 的表达归一化到内参 18s 的表达。数据处理统计分析实验数据以均数±标准差表示，应用 SPSS 11.0 统计软件进行student ttest 检验，以<0.05 为有差异。
2 结果
miR-21 对人心脏成纤维细胞smad7 表达的影响：人心脏成纤维细胞转染 miR-21 抑制剂或者阴性对照 48 小时后，提取总RNA，反转录成 cDNA，实时荧光定量 PCR 结果见图1。

Fig 1 Real time analysis results of Smad7 mRNA expression. p>0.05
3 讨论：
miR-21与TGF信号通路广泛参与其它器官的纤维化2-3，我们因此试图在心肌细胞中验证 miRNA-21 是否也是通过抑制TGF信号通路中的重要信号分子Smad7基因的表达对心肌细胞纤维化产生作用。我们转染人心脏成纤维细胞 miR-21抑制剂后，发现 miR-21 被明显抑制，Smad7 mRNA 基因绝对定量结果显示 100nM miR-21 抑制剂对 Smad7  mRNA 的表达无显著影响，我们采用绝对定量方法计算出 18S 和Smad7 mRNA的表达量，并且采用保守的 18s 作为内参，将 Smad7 的表达归一化到内参 18s 的表达。我们观察到 smad7mRNA 的表达
有上调的趋势，改变转染的 miRNA 浓度或者增加例数或许会得到表达差异的显著性。本课题旨在揭示心肌成纤维细胞纤维化的发病机制以及为心力衰竭治疗方法提供新的思路和实验依据。
参考文献
[1]Roy S,Khanna SR,et al.MicroRNA expression in response to murine myocardial infarction:miR-21 regulates fibroblast metalloprotease-2 via phosphate ase and tensin homologue[J].Cardiovascular Research, 2009,82(1):21-29.
[2]Thum T,Gross C,Fiedler J,et al,MicroRNA-21 contributes to myocardial disease by stimulating MAP kinase  signaling  in fibroblastes. [J].Nature,2008,456; 980-984.
[3]Liu G et al.MiRNA-21 mediates fibrogenic activation of pulmonary fibroblasts and lung fibrosis.[J].J Exp Med,2010,207:1589-1597.
基金项目：国家自然科学基金面上项目（81070128）；l辽宁省杰出青年学者成长计划（教育厅优秀人才项目  No. L2011112）；教育部留学启动基金（20121707）；人力资源与社会保障部科技项目择优资助(2015)；沈阳医学院优秀人才项目（20113067）。大学生科研立项课题（20141038）